不過你知道嗎？常見的顯微鏡觀察方法就有七種之多（材料應(yīng)用五種），下面就來給大伙兒講講各個方法的不同在于哪里，我們應(yīng)該如何取舍。
明場（BF）
明場成像是最常見的顯微鏡觀察方式，也是觀察生物樣品和材料樣品最常用的觀察方式。顯微鏡下你第一次看到的明場圖像是什么？應(yīng)該是生物課上透射光明場下的紫色洋蔥表皮細(xì)胞吧！
生物研究中經(jīng)常使用的免疫組化染色也是明場成像，根據(jù)標(biāo)記方式不同樣本會呈現(xiàn)不同顏色，也可利用抗體標(biāo)記或染料顯色來區(qū)分不同組分。
下圖HE中細(xì)胞核被標(biāo)記為藍(lán)色，胞漿則被染色成粉紅色。
▲HE染色和TMA標(biāo)本中的DAB染色
這個方法簡單有效，成本低。但是由于標(biāo)記的成分?jǐn)?shù)量有限，致使應(yīng)用范圍不廣，對比也不太明顯，無法判斷陽性結(jié)果。
觀察不透明的材料樣品，反射光明場是使用最多的觀察方式。光源直接照射到樣品表面，表面的結(jié)構(gòu)對照射光有不同程度的反射和吸收，圖像的亮暗就反映樣品表面的粗糙度和吸光情況。
下圖是反射光明場觀察方式的結(jié)構(gòu)和金屬純鋁明場下的圖像，借助明場圖像可以清晰的獲取純鋁晶粒的大小和形態(tài)。
暗場（DF）
暗場成像與明場成像相對應(yīng)，顧名思義，人不會直接觀察到照明光線，而是光線斜射到標(biāo)本的表面，根據(jù)丁道爾(Tyndall)現(xiàn)象，微粒對斜射光進(jìn)行反射或衍射，增大了人眼可見性，我們才能夠觀察到極其微小的物體。
▲透射暗場成像光路原理▲透射暗場成像光路原理
那么如何實(shí)現(xiàn)暗場成像呢？透過顯微鏡剖面圖，我們可以看到，聚光鏡以高度角將一個光錐對準(zhǔn)標(biāo)本，這樣部分光線就不會直接進(jìn)入物鏡。通過標(biāo)本的光被光學(xué)不連續(xù)物(如細(xì)胞膜、細(xì)胞核和內(nèi)部的細(xì)胞器)衍射、反射和折射，再次進(jìn)入物鏡，然后該樣品就可以被看作是在黑色背景上的一個明亮的物體。
蔡司君通過幾張圖片，帶大家見識一下暗場下的微觀世界。
▲透射暗場觀察的標(biāo)本圖像：水蚤，寄生蟲，水蝸牛，花粉粒
總的來講，暗場適合觀察微小粒子、細(xì)菌形態(tài)、細(xì)菌記數(shù)、透明標(biāo)本等，能夠看到標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)。
不幸的是，物體散射的光會影響成像，從而降低對比度、模糊標(biāo)本細(xì)節(jié)。同時，標(biāo)本中的灰塵和碎片也對生成的圖像有影響。
此外，較薄的貼壁細(xì)胞通常信號很弱，而較厚的植物和動物組織會將過多的光線重新定向到物鏡內(nèi)，這樣將降低成像的對比度，因此暗場成像對標(biāo)本的要求較高。
觀察材料樣品的暗場結(jié)構(gòu)跟生物的有點(diǎn)不一樣（參看左下圖）。反射光暗場能夠反映樣品表面的超微小結(jié)構(gòu)，能夠觀察到小至0.004um的結(jié)構(gòu)。但由于微小結(jié)構(gòu)對于光散射或衍射的原因，暗場下并不能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的測量，所以暗場僅適合觀察，用于一些超微小結(jié)構(gòu)和缺陷的定位。當(dāng)然，反射光暗場也有另外一個小用途，可以獲取透明或半透明材料的顏色，如PCB板的綠油，鐵銹的顏色等等。
相差也是一種很常見的觀察方式，用來進(jìn)行活細(xì)胞成像。由于細(xì)胞在明場下輪廓不清，雖然可以觀察到，但其邊界或內(nèi)部結(jié)構(gòu)無法分辨清楚。
相差利用光程差（相位）這種人眼無法區(qū)分的技巧，光通過不同厚度標(biāo)本時的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢杂^察到的明暗變化，從而對標(biāo)本的結(jié)構(gòu)有了區(qū)分。
▲相差觀察原理
透過原理圖，我們不難發(fā)現(xiàn)相差成像的關(guān)鍵在于相差環(huán)的匹配，聚光鏡中必須和相差物鏡的相差環(huán)匹配。當(dāng)觀察或成像培養(yǎng)的活細(xì)胞時，相差是一種很好的增強(qiáng)對比度的方法，但通常會導(dǎo)致邊緣特征輪廓周圍出現(xiàn)光暈，而這些光暈是光學(xué)偽影，會降低邊界細(xì)節(jié)的可見性。
▲明場和相差觀察下的細(xì)胞
另一方面，該方法對厚標(biāo)本并不有用，因?yàn)橐坏┻h(yuǎn)離焦面，相位就會發(fā)生變化，這會扭曲圖像細(xì)節(jié)。此外，漂浮的碎片和其他失焦的物體會干擾對貼壁細(xì)胞的成像。
▲相差觀察和熒光成像疊加
偏光（POL）
偏光顯微鏡具有很高的靈敏度，可用于針對各種各向異性樣品的定性和定量研究。定性偏振光顯微鏡在實(shí)踐中非常流行，然而偏振光顯微鏡的定量方面，主要應(yīng)用于晶體學(xué)，礦物學(xué)、地質(zhì)學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域。
▲偏光顯微鏡的原理
偏振光顯微鏡是通過在聚光鏡之前和物鏡之后插入交叉偏振元件實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞內(nèi)具有雙折射特性的組分會旋轉(zhuǎn)光的偏振平面，在深色背景上顯得明亮。
▲小鼠在偏光下可以看到不同的肌纖維排列
在過去的幾年里，高靈敏度偏振光顯微鏡取得了穩(wěn)定的進(jìn)展，這使得生物學(xué)家能夠檢測各向異性亞細(xì)胞組合的雙折射特性。例如骨骼、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)等。
對于不透明的材料樣品也可進(jìn)行偏光觀察，但需要反射光偏光模式，以此來分析材料的雙折射性，甚至結(jié)合特殊的制樣也可區(qū)分材料結(jié)晶顆粒的晶體取向。
▲反射光偏光結(jié)構(gòu)示意
微分干涉(DIC)
微分干涉（DIC）是七種觀察方式中最復(fù)雜的一種。光路中不僅包括偏光組件，還要包括一組特制棱鏡，以放大樣品厚度梯度和折射率的微小差異。例如，由于細(xì)胞的水相和脂質(zhì)相之間的折射率差異，脂質(zhì)雙層可以在DIC中產(chǎn)生出色的對比度。
▲微分干涉光路原理
此外，貼壁相對平坦的哺乳動物和植物的細(xì)胞，包括細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞核、液泡、線粒體和壓力纖維，這些細(xì)胞邊界通常有顯著的梯度，很容易進(jìn)行DIC成像。
在植物組織中，雙折射細(xì)胞壁雖在一定程度上降低DIC的對比度，但依舊能顯示表皮細(xì)胞中的核膜、液泡膜、一些線粒體、葉綠體和凝聚的染色體。與相差相比，DIC的成像效果能夠避免細(xì)胞邊緣的光暈。
▲相差成像（a,c,e）和DIC成像（b,d,f）
微分干涉成像使樣品出現(xiàn)一種立體感，效果更加直觀，但其光路配件復(fù)雜，調(diào)節(jié)難度大。由于微分干涉是基于偏振光原理，高雙折射樣品或嵌入雙折射材料的樣品不適合微分干涉觀察。
例如，微分干涉不能用于觀察塑料皿內(nèi)的樣品，但是塑料皿適合細(xì)胞培養(yǎng),可以通過蔡司特有的PlasDIC的方法，在塑料皿中進(jìn)行活細(xì)胞微分干涉觀察。
▲PlasDIC成像效果
對于材料樣品來講，微分干涉（DIC）觀察方式也越來越受重視和歡迎。但是對于那些有多個方向結(jié)構(gòu)的材料，DIC已經(jīng)滿足不了觀察需求，蔡司的圓微分干涉由于把線偏振光換成圓偏振光，能夠一次對樣品上360度取向的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，避免了繁瑣的樣品旋轉(zhuǎn)。
▲反射光C-DIC結(jié)構(gòu)示意
霍夫曼調(diào)制相差（HMC）
霍夫曼調(diào)制相差（HMC）利用斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對比度。
霍夫曼調(diào)制相差不會因在光路中使用雙折射材料而受到阻礙，因此該技術(shù)對于檢查由聚合材料制成的容器中的樣本更為有用。
而它不利的一面是，HMC會產(chǎn)生許多光學(xué)偽像，使該方法用于在玻璃蓋玻片上進(jìn)行貼壁細(xì)胞成像時比相差或DIC效果差。
▲HMC觀察魚胚胎
這里蔡司君補(bǔ)充一點(diǎn)，還有一種新開發(fā)的觀察技術(shù)，可看作相差與傾斜單邊照明的結(jié)合（類似于HMC），用于檢查培養(yǎng)容器中的活細(xì)胞。
當(dāng)斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，通過物鏡相襯板產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對比度。
▲VAREL斜照明成像原理
07熒光成像（FL）
